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XTBG OpenIR  > 西双版纳热带植物园毕业生学位论文  > 学位论文

title: 蒺藜苜蓿花发育基因TCP 和WFL1 的功能分析
author: 阳天泉
Issued Date: 2016-11
Abstract: 花对称性(Floral Symmetry)是被子植物花结构的典型特性之一,根据其花
冠对称性可分为辐射对称(actinomorphy),两侧对称(zygomorphy)以及不对
称(asymmetry)三种形式。已有研究表明,CYC 同源基因在不同物种都调控两
侧花型发育。在豆科植物百脉根(Lotus japonicus)和豌豆(Pisum sativum)中,
CYC 类基因通过复制产生3 个拷贝,它们共同决定豆科植物两侧对称花型背腹
极性的发育。
在蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)Tnt1 插入突变体库中,我们筛选到MtCYC1
和MtCYC2 基因突变体。其中MtCYC2 突变体(lob standard 1,ls1)为单位点隐
性突变,表现为背部花瓣上部出现对称凹陷。MtCYC1 突变体(normal petals,
npe)花发育与野生型无明显差异。通过遗传杂交获得的纯合双突变体npe/ls1,
背部花瓣内部对称属性消失,其形状和大小类似于内部不对称的侧部花瓣,导致
整个花器官两侧对称形态丢失。基因表达分析显示,MtCYC1 和MtCYC2 具有相
似的表达模式,都在发育的背部花瓣具有最高水平的表达。这些结果表明
MtCYC1 和MtCYC2 是花瓣背部属性建立的关键因子,对背部花瓣属性建立有部
分功能冗余。MtCYC3 在npe/ls1 双突变体中表达较野生型上调,说明MtCYC3
在背部花瓣的表达可能受MtCYC2 和MtCYC1 抑制。为了调查MtCYC1 和MtCYC2
如何维持其在背部花瓣表达,以及它们发挥作用的机制,我们做了进一步研究。
首先在MtCYC2 基因的启动子区域预测到TCP 蛋白的结合位点GGGCCCT,酵
母单杂交结果显示:MtCYC1 和MtCYC2 都能与该靶序列结合。为了进一步证
实MtCYC1 和MtCYC2 调控MtCYC2 基因,我们设计了一个effector-reporter 瞬
时表达系统。将MtCYC2 基因的启动子与荧光素酶基因融合作为reporter,将
MtCYC1 和MtCYC2 分别与CaMV35S 启动子融合作为effector。瞬时共表达实验
显示,MtCYC1 和MtCYC2 都负调控MtCYC2 的表达。酵母双杂交和双分子荧
光互补实验显示,MtCYC1 和MtCYC2 存在相互作用,并且它们自身能够形成
同源二聚体。这些结果表明:MtCYC1 和MtCYC2 以形成同源或者异源二聚体
形式发挥作用。
通过正向遗传学筛选突变体库发现一个新的突变体:5 枚花瓣形态和大小类
似旗瓣(dorsalized petals,dsp1),柱头和雄蕊不能形成野生型弯曲的形态,雄蕊直立散生,不能正常包围柱头。遗传分析表明该突变体是由单位点显性基因控
制。dsp1 突变体表型为所有花瓣背部化,我们猜测DSP1 基因与NPE 和LS1 可
能有调控关系。通过遗传杂交获得dsp1/ls1 双突变体,表型与dsp1 单突变体相
似,说明DSP1 可能是位于LS1 的上游调控因子。qRT-PCR 检测MtCYC 基因在
野生型和dsp1 突变体背景中的表达差异,结果发现:在dsp1 突变体花芽中,
MtCYC1 和MtCYC2 表达量都显着上调。MtCYC1 在dsp1/ls1 双突变体中表达上
调。原位杂交也显示:MtCYC1 和MtCYC2 只在野生型背部花瓣表达;而在dsp1
突变体所有的花瓣都有表达。结果说明:DSP1 在花发育早期抑制MtCYC1 和
MtCYC2 的表达;dsp1/ls1 双突变体中可能是MtCYC1 发挥着建立背部花瓣属性
的功能。
植物的表皮蜡质覆盖于植物各器官和组织表面,是植物自我防护的一道屏
障,在植物适应干旱环境及各种非生物和生物逆境中发挥重要的作用。蜡质是特
长脂肪酸链的衍生物,C16 或者C18 脂肪酸在内质网上延伸成特长链脂肪酸。在
模式植物拟南芥中,长链脂肪酸的合成途径以及蜡质合成已有大量研究,而豆科
模式植物蒺藜苜蓿研究较少。本研究在Tnt1 插入突变体库中正向筛选到一个新
的单位点隐性突变体wfl1(winkled flower and leaf 1),花瓣不能正常展开并包裹住雄蕊,只外露出不可育的雌蕊,叶片融合。根据候选基因与突变体的连锁分
析,以及反向筛选该候选基因的突变体,确认突变表型,成功定位wfl1 目的基
因。WFL1 基因编码一类β-酮脂酰-CoA 合酶(KCS),催化长链脂肪酸延长的起
始步骤。该论文对其功能进行了初步研究:扫描电镜显示野生型和wfl1 突变体
叶片表皮蜡质差异很明显,突变体表皮蜡质晶体密度降低,蜡质立体形态变得更
短更薄。TB 测试检测叶片表皮渗透性,结果显示wfl1 突变体叶片比野生型更容
易被染色,说明突变体叶片表皮通透性增加。杂合子自交后正常植物与突变体比
例符合3:1,说明wfl1 是单位点隐性基因控制。以拟南芥21 个KCS 蛋白序列
为探针,在蒺藜苜蓿基因组数据库中得到28 个同源性较高的序列。系统进化树
显示,蒺藜苜蓿的28 个KCS 蛋白在KCS 家族的4 亚类(FAE1-like,FDH-like,
CER6,KCS1-like)都有分布,但是分布的数目变化较大。WFL1 与拟南芥FDH
基因(AT2G26250)关系最近,并且wfl1 突变体与fdh 突变表型相似。结果表明,尽管KCS 基因在FDH-like 亚类分化较大,但是基因功能保守。qRT-PCR 检测
WFL1 的表达模式,结果显示WFL1 在植物营养期和生殖期顶端、花瓣、柱头和
雄蕊中有很高的表达,其次是茎、叶和萼片。进一步用原位杂交实验调查WFL1
不同组织和不同发育时期的表达,结果显示在叶原基发育过程中的外层细胞表达
较强;花原基早期发育阶段各轮器官,如萼片,花瓣,柱头,雄蕊都有表达,在
花药发育成熟后期表达下调,而在花瓣,柱头及胚珠发育过程中持续高表达。通
过气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析叶片脂肪酸成分和含量,结果显示wfl1 突
变体叶片脂肪酸含量显着低于野生型;脂肪酸成分发生剧烈变化,超长链脂肪酸
比例显着增加,亚麻酸比例显着减少,不饱和度降低。结果说明WFL1 基因功能
缺失引起蒺藜苜蓿超长链脂肪酸代谢紊乱。
关键词:花发育,背腹极性,TCP 基因,KCS 基因,蒺藜苜蓿
Degree Level: 博士
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阳天泉. 蒺藜苜蓿花发育基因tcp 和wfl1 的功能分析[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2016.
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