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小桐子细胞分裂素和油菜素甾醇合成关键酶基因的功能分析
Alternative TitleFunctional analysis of key enzyme genes in cytokinin and brassinosteroid biosynthesis pathways in Jatropha curcas
蔡黎
Subtype博士
Thesis Advisor徐增富
2018-05
Degree Grantor中国科学院研究生院
Place of Conferral北京
Degree Discipline植物学
Keyword细胞分裂素 油菜素甾醇 合成关键酶 小桐子 Crsipr/cas9 转基因
Abstract细胞分裂素和油菜素甾醇作为调控植物生长发育的重要激素,参与了植物
诸多的生理过程。例如,细胞分裂素调控植物细胞的增殖和分化,植物的生
长、生殖以及衰老、根的生长等。油菜素甾醇能够促进茎的伸长、控制植物暗
形态的建成以及木质部的分化。小桐子是大戟科多年生的木本油料植物,它的
种子油被认为是一种能替代传统化石能源的潜在原料。然而,由于小桐子分枝
数目有限、雌雄花比例低的问题限制了它的产量,不能满足生物燃油产业化的
需求。本实验前期的研究表明,外施细胞分裂素6-BA 可以促进小桐子单个花
序的总花数目增加,并显著提高雌雄花比例,使得小桐子种子产量显著增加。
在拟南芥和水稻中超量表达油菜素甾醇合成酶基因DWF4 可以提高生物量、促
进分枝或分蘖,并显著增加种子的产量。本研究对小桐子细胞分裂素和油菜素
甾醇合成关键酶基因进行了分离鉴定,并采用CRISPR/Cas9 基因编辑技术对
JcCYP735A 进行了功能分析;并在小桐子中超量表达了JcDWF4,分析了其在
小桐子中的生物学功能。主要研究结果如下:
1.分离鉴定了小桐子中的细胞分裂素合成与代谢关键酶异戊烯基转移酶基
因JcIPT、磷酸核糖水解酶基因JcLOG、细胞色素单加氧酶基因JcCYP735A 和
细胞分裂素氧化酶基因JcCKX 的家族成员,其中6 个JcIPT 基因家族成员,9
个JcLOG 基因家族成员,1 个JcCYP735A 基因家族成员,7 个JcCKX 基因家族
成员,并利用了荧光定量PCR 对它们在小桐子中各组织部位的表达谱进行了分
析。
2. 利用花序特异性启动子PJcAP1 和脱落酸(ABA)诱导启动子PpvSARK 分别
驱动JcLOG7 和JcCYP735A 的表达。结果表明在所有的转基因植株中尽管都检
测到了相应的JcLOG7 或JcCYP735A 表达量的增加,但是它们的表型与野生型
没有差别,并且细胞分裂素下游信号基因表达量变化不大,这表明单个
JcLOG7 或JcCYP735A 超过正常水平的表达对小桐子无显著影响。
3. 本研究在小桐子中成功利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术完成了对
JcCYP735A 基因的敲除。通过对JcCYP735A 基因敲除的小桐子突变体研究发现,与野生型相比,突变体叶片中的反式玉米素(tZ)的含量大幅减少,并且
T0 代转基因植株的种仁发育不良,T1 代转基因植株的茎生长受阻。这些结果表
明, JcCYP735A 合成tZ 的途径是小桐子中合成tZ 的主要途径,并且
JcCYP735A 通过调控tZ 的合成控制着小桐子茎和种仁的生长发育。此外,本
研究也意味着CRISPR/Cas9 技术可以在木本植物小桐子中进行应用,为小桐子
基因功能研究和转基因育种提供了新的技术手段。
4. 我们在拟南芥突变体dwf4 中通过互补实验验证了JcDWF4 的功能,并
在拟南芥超量表达了JcDWF4。通过对转基因植株的观察发现,拟南芥超量表
达JcDWF4 会促进生长,但会使叶片卷曲、茎干变软,并且不会增加分枝数
目。超量表达JcDWF4 的转基因小桐子与野生型相比,BR 总含量增加,植株
变矮,茎中木质部比例减少,其中赤霉素(GA)中的GA1 和GA4 含量降低,
但花序柄变长,其中的GA1 含量升高,果实与种子变大,种子单粒重增加。对
T1 代转基因植株的观察发现,超量表达JcDWF4 转基因小桐子幼苗的生长发育
速度加快,茎和叶柄变长,成年株表型与T0 代一致。上述这些结果表明,超量
表达JcDWF4 可以促进幼苗以及成年植株生殖器官的发育,抑制成年植株茎的
生长并减少茎中的木质部含量,这些表型变化可能是通过控制GA 的合成来进
行的。
关键词:细胞分裂素,油菜素甾醇,合成关键酶,小桐子,CRSIPR/Cas9,转
基因
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.xtbg.org.cn/handle/353005/10956
Collection西双版纳热带植物园毕业生学位论文
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GB/T 7714
蔡黎. 小桐子细胞分裂素和油菜素甾醇合成关键酶基因的功能分析[D]. 北京. 中国科学院研究生院,2018.
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